Odpravljanje težav z elektroforezo v gelu

Vsebina

Navodila
Kako
Obvestilo
Kaj potrebujete

Elektroforeza s poliakrilamidnim gelom ali PAGE je tehnika, ki se uporablja za ločevanje organskih molekul v biološkem vzorcu. Molekule manjših velikosti in teže se hitreje selijo v poliakrilamidni gel, ko uporabite električni tok. Ostre ločene pasove običajno opazimo po inkubaciji končnega gela na mestu. To je relativno preprosta metoda. Vendar pa odsotnost pasov, trakov, ki so zamegljeni ali ki niso jasni, lahko kažejo na problem v enem ali več korakih metode. Pri reševanju problemov metode elektroforeze v gelu, pri kateri rezultati niso pričakovani, morate upoštevati osnovne smernice.

Navodila

Elektroforeza z gelom je običajna metoda za ločevanje beljakovinskih ali DNA vzorcev (Jupiterimages / Comstock / Getty Images)

Začnite z zadnjim korakom elektroforeze v gelu in delajte retroaktivno. Za gelno elektroforezo je končni korak postopek barvanja, ki se uporablja za opazovanje vzorčnih pasov. Med procesom obarvanja bi se moralo pojaviti le nekaj težav. Vendar je treba barvilo za madeže dobro raztopiti v ustreznem pufru, preden ga uporabimo za obarvanje gela. Preverite, ali je bila uporabljena pravilna koncentracija barvila.
Preverite vir napajanja. Odsotnost pasov lahko kaže, da je tokovna ali napetostna konfiguracija previsoka in da preskusni vzorci migrirajo iz gela. Visoke nastavitve lahko povzročijo, da se komponente vzorca prehitro premikajo skozi gel, kar povzroči slabo ločljivost in nejasne pasove. Vzorci se ne smejo seliti skozi gel, če je konfiguracija vira energije nizka. Vzorci se lahko kopičijo tudi v vdolbinici, kjer so bili naloženi, in ne migrirajo skozi gel.
Preverite tekoči akrilamid, ki se uporablja za pretvorbo poliakrilamidnega gela. Običajno je delež akrilamida, uporabljenega za pretvorbo poliakrilamidnega gela, v razponu od 5% do 15%. Vzorce, ki so sestavljeni iz večjih molekul, naložimo na 5% gel, ker se veliki fragmenti v gelu gibljejo počasneje z višjim odstotkom akrilamida. Majhne molekule se naložijo na višji odstotek gela, ker nizka koncentracija gela ne more obdelati manjših vzorcev.
Preverite reagente, uporabljene za polimerizacijo akrilamida. Poliakrilamidni gel tvorimo s polimerizacijo tekoče zmesi, ki sestoji iz bis-akrilamida in akrilamida. Amonijev persulfat in TEMED dodamo k akrilamidu, da kataliziramo tvorbo gela. Značilno je, da naj bi akrilamid pokazal znake polimerizacije (tvorba gela) 15 minut po dodajanju amonijevega persulfata in TEMED-a. Polimerizacija, ki se zelo hitro pojavi, je posledica velikih količin amonijevega persulfata. Če ni dovolj, lahko povzroči nepopolno ali neenakomerno polimerizacijo.
Potrdite količino naloženih vzorcev. Visoke koncentracije vzorcev se lahko počasi premikajo skozi gel in zmanjšajo ločljivost pasu. Nizka koncentracija vzorca se ne sme opaziti, ko je gel obarvan. Te barve predstavljajo omejitve na najmanjšo količino vzorca, ki jo je mogoče vizualizirati zaradi občutljivosti na barvo.
Potrdite kakovost naloženih vzorcev. Soli in drugi kontaminanti, ki so prisotni v vzorcu, lahko vplivajo na gibanje vzorca vzdolž gela. Elektroforeza je posledica prenosa električnega toka skozi gel, ki vsebuje prevodni tok; visoke koncentracije soli v vzorcu lahko vplivajo na gibanje tega toka skozi gel. Pri izoliranju vzorca je treba vključiti komplet za čiščenje, da dobimo relativno čist vzorec.
Preglejte literaturo ali pisni protokol, da ugotovite, ali je bila za izvedbo poskusa uporabljena pravilna "PAGE". Odstotek akrilamida v "PAGE" je specifičen za velikost vzorca, ki se preskuša. V literaturi so lahko podane tudi specifične informacije o določitvi vira energije in hitrosti migracije vzorca.

Kako

Navedene smernice so splošne za uporabo v bioloških raziskavah.
Pri reševanju kakršnega koli laboratorijskega postopka je najbolje, da začnemo z zadnjim korakom in delamo retroaktivno, da ugotovimo problem.

Obvestilo

Pri ravnanju z akrilamidom in poliakrilamidom nosite rokavice. Akrilamid je nevrotoksičen reagent in se lahko absorbira skozi kožo. Poliakrilamid ni nevrotoksičen, vendar pogosto vsebuje nepolimeriziran akrilamid in je še vedno lahko strupen.