Vsebina
- Odkrivanje z uporabo sprememb barve
- Uporaba merilnika ELISA za merjenje
- Neposredna konkurenčna ELISA (citokrom c)
- Inkubirajte primarno protitelo v epruvete
Test ELISA je encimsko vezan imunski test, ki uporablja protitelesa ali antigene, povezane z določenim encimom, da pomaga določiti koncentracijo protitelesa ali antigena. Če jemljete test ELISA in ne morete uporabiti specifičnih protiteles za doseganje rezultatov, predlagamo kompetitivni test ELISA, ker uporablja antigen, konjugiran na encim, namesto protitelesa in drugačno metodo detekcije.
Odkrivanje z uporabo sprememb barve
Skupni protokol za konkurenčni ELISA je uporaba neoznačenega in prečiščenega primarnega protitelesa. Protitelesa prevlečejo v jamice mikrotitrske plošče in se inkubirajo z neznanimi standardi. Nato se doda imunogen, da se konjugira s primarnim protitelesom, ki se veže na mesta protiteles, ki še niso zasedena. Substrat se nato uporabi za ustvarjanje spremembe barve za merjenje koncentracije vezave.
Uporaba merilnika ELISA za merjenje
Uporabite mikrotitrsko polistirensko ploščo in dodajte primarno protitelo v vsako vdolbinico. Da bi dosegli maksimalno vezavo, napolnite vdolbinico z enim mikrogramom protitelesa. Plošča se inkubira štiri ure pri sobni temperaturi. Dodamo primarno zajeto protitelesce in izperemo vdolbinice s PBS (fosfatno pufrano slanico). Plošče inkubiramo z blokirnim pufrom za dve uri pri sobni temperaturi. Vrtine dvakrat ponovno speremo s PBS in dodamo standarde. Raztopino antigen-konjugat postavimo v vdolbinice in ponovno inkubiramo dve uri. Ponovno sperite ploščo s PBS štirikrat. Dodamo substrat in izmerimo gostoto na določeni valovni dolžini z uporabo ELISA čitalnika.
Neposredna konkurenčna ELISA (citokrom c)
Za neposredni kompetitivni ELISA je treba opraviti analizo serumske razredčitve za antigen, ki ga uporabljate v poskusu. Mikrotitrsko ploščo nato prevlečemo s citokromom c in inkubiramo preko noči. Del testa ELISA se nato izvede z dodatkom blokirnega reagenta in sekundarnih protiteles. Rezultate absorbance odčitamo z bralnikom mikroplošče.
Inkubirajte primarno protitelo v epruvete
Pri tem postopku se primarno protitelo inkubira v epruvetah, v katere se veže antigen, ki nas zanima. Vzorce nato dodamo v vdolbine mikrotitrskih plošč in inkubiramo. Vdolbinice nato speremo, da odstranimo vse nevezane komplekse antigen-protiteles in nato dodamo blokirno raztopino, da preprečimo, da bi se drugo protitelo vezalo na vdolbine. Sekundarno protitelo nato preberemo na čitalniku plošč, da dobimo rezultate.