Kako narediti agarozne gele

Video.: Креатин киназа : Изоензими и клинички значај: ЦК, ЦК-МБ или цк2

Vsebina

Navodila
Priprava agaroznega gela
Obvestilo
Kaj potrebujete

Agarozne gele izdelajo znanstveniki, ki delajo v laboratorijih za molekularno biologijo, da preučijo fragmente DNA, ki so bili spremenjeni med eksperimentalnim delom. Tehnika izdelave agaroznega gela je temeljna rutinska spretnost, ki jo morajo vsi raziskovalci obvladati, saj omogoča neposredno vizualizacijo različnih velikosti DNK za projekte verifikacije in genskega kloniranja. Čeprav priprava gela ni težavna, kot pri vseh laboratorijskih postopkih, jo sme preskušati le strokovnjak, ki je zaradi bioloških tveganj znanstveno usposobljen.

Navodila

Kako narediti agarozne gele (Comstock Slike / Comstock / Getty Images)

Priprava agaroznega gela

Prepričajte se, da gelne baze nimajo razpok ali ničesar, kar bi lahko povzročilo uhajanje vroče agaroze. Pladnji s 70% alkoholom očistite in pustite, da se popolnoma posuši. Podnožje ima dva odprta konca in dva zaprta konca. V nekaterih oblikah so posnetki opremljeni z njimi, da se zaprejo konci, večina pa mora biti zaprta tako, da se med odprtimi deli položijo trakovi. Trak trdno in trdno pritisnite, saj se lahko odmaknejo od držala in omogočijo puščanje vroče agaroze.
Glede na velikost fragmenta DNA, ki ga ločimo in analiziramo na agaroznem gelu, določimo ustrezen odstotek, ki bo potreben. Na primer, pri 1% (mas./vol.) Bo agarozni gel učinkovit za analizo 0,5 do 10 kb DNA segmentov. Višji kot je odstotek (več agaroze), manjši delci, ki jih je mogoče ločiti. Rutinski poskusi uporabljajo razpon od 0,5% do 2% agaroze. Za 1% agaroznega gela stehtajte 1 g agaroznega prahu v kemičnem povoju ali drugem zadrževalnem sistemu. Previdno prenesite v laboratorijsko območje za pripravo gela.
V ustreznem območju za pripravo gela izmerite 100 ml pufra za elektroforezo. Mora biti pri sobni temperaturi. Prenesite agarozni prašek v ognjevarno bučko in vlijte izmerjeni volumen pufra za elektroforezo. Nežno segrejte zmes v mikrovalovni pečici, vendar je ne kuhajte, ker lahko izhlapevanje spremeni odstotek prisotne agaroze. Poskrbite, da se raztopi vsa agaroza, dobro pretresite, da se dobro premeša, pustite, da se rahlo ohladi in nato dodajte 0,5 mikrograma na mililiter etidijevega bromida. Ne vdihavajte hlapov, saj lahko to draži pljuča in tkivo sluznice. Raztopine tudi po segrevanju etidijevega bromida se ne segreva. Ponovno pretresite, da se zmeša, nato pa, ko je raztopina še dovolj vroča, da se razlije, jo dodajte v pripravljeno podlago. Upoštevajte, da če je prisoten velik volumen vzorca ali majhna koncentracija DNA, se lahko naredi debelejši gel. Vendar pa so lažji geli lažje analizirati, ker bodo bolj jasno fotografirani.
Vstavite glavnike v gel, da ustvarite utore ali vdolbinice za vzorec, ki ga želite postaviti. Pustite, da se nekaj ur ohladi na sobno temperaturo ali nekaj minut v hladilniku. V slednjem primeru je treba po pripravi gela opaziti prisotnost kristalov agaroze. Na splošno izginejo, če se gel pusti, da se nekaj minut pred uporabo segreje na sobno temperaturo na pultu. Previdno odstranite glavnike, da ne raztrgate gela ali zlomite vdolbinic. Agarozni gel je sedaj pripravljen za uporabo. Če ga ne uporabite takoj, ga morate zaviti v celofan ali shraniti v plastični posodi v hladilniku, da se prepreči izsušitev ali taljenje.

Obvestilo

Uporabljeni reagenti so možne rakotvorne snovi in z njimi je treba ravnati previdno in ustrezno zaščititi. Če je med pripravo gela prišlo do napake, je nikoli ni treba ponovno segrevati, ampak odstraniti in ponovno pripraviti nov gel.